De tweekleurige parelmoervlinder komt voor op schrale graslanden, steppeachtige vegetaties en droge ruigtes langs rotsen en op hellingen. Ook op verwaarloosde en marginale landbouwgronden wordt de soort regelmatig gezien. Als waardplanten komen veel verschillende plantensoorten in aanmerking: Plantago (weegbree), Linaria (vlasleeuwenbek), Veronica (ereprijs), Digitalis (vingerhoedskruid), Stachys (andoorn), Valeriana (valeriaan) en Verbascum (toorts) soorten. De eitjes worden in groepen op de onderkant van bladeren dicht bij de grond afgezet. In het begin leven de jonge rupsen in een los spinsel bij elkaar, maar al snel sonderen ze zich af of er blijven slechts kleine groepjes over. De overwintering gebeurt solitair of met weinig bij elkaar in een spinselnest. De verpopping vindt dicht bij de grond plaats. De tweekleurige parelmoervlinder vliegt in een tot drie generaties per jaar, afhankelijk van de geografische ligging en hoogte van het vliegterrein. Deze soort is bijzonder variabel in de vleugeltekening. Een soort van Z- en Centraal-Europa. Komt voor ten zuiden van een lijn van Midden-Frankrijk via Midden-Duitsland, NO-Polen en ZO-Letland. Ontbreekt tevens op de mediterrane eilanden behalve Sicilië, Elba, Corfu, Lefkada, Evia, Thasos, Limnos, Lesbos, Chios en Samos. Vliegt van zeeniveau tot 2400m.

Vliegtijd: april, mei, juni, juli, augustus, september.
Status Europa: Soort is thans niet bedreigd in Europa.
Status Benelux: In Nederland dwaalgast, in Wallonië trekvlinder. Dichtstbij gelegen populaties in de Vogezen, het Rijndal en de Schwäbische Alb.